熒光共定位分析是對(duì)細(xì)胞中兩種帶有熒光標(biāo)記的蛋白、細(xì)胞器或者藥物、納米材料等之間的空間相互位置關(guān)系進(jìn)行分析，以確定它們是否定位于同一區(qū)域或存在相關(guān)性，在細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、醫(yī)學(xué)、植物學(xué)等研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。
最直觀最簡(jiǎn)單的共定位分析就是直接看不同顏色的熒光之間是否重疊，比如蛋白A標(biāo)有綠色熒光，蛋白B標(biāo)有紅色熒光，如果蛋白A和B共定位則綠色紅色疊加顯示為黃色（圖1）。只是這種方式無(wú)法提供準(zhǔn)確的定量結(jié)果，已無(wú)法滿足科研工作者越來(lái)越高的要求。所以我們需要可以提供量化結(jié)果的更專業(yè)的共定位分析。
LAS X軟件作為L(zhǎng)eica顯微成像系統(tǒng)的搭載平臺(tái)，不僅能夠提供完美的成像質(zhì)量，而且整合了眾多高級(jí)應(yīng)用并具有強(qiáng)大的后期數(shù)據(jù)處理分析功能，包括FRAP功能、FRET功能，圖像2D、3D測(cè)量與自動(dòng)分析功能，當(dāng)然也有共定位分析功能Colocalization analysis，且操作非常簡(jiǎn)單，下面我們就來(lái)看看徠卡的共定位分析怎么做吧！
1 進(jìn)入Quantify
2 在Tools中選擇Colocalization
共定位分析是對(duì)兩個(gè)熒光通道之間進(jìn)行分析，所以對(duì)于通道數(shù)多于兩個(gè)通道的數(shù)據(jù)，需要先確定分析哪兩個(gè)，把暫不分析的通道點(diǎn)灰，即可得到共定位結(jié)果及散點(diǎn)圖。
散點(diǎn)圖Cytofluorogram：兩熒光通道中熒光信號(hào)的空間分布和熒光強(qiáng)度的二維散點(diǎn)圖，如x軸為綠色信號(hào)，y軸為紅色信號(hào)，根據(jù)每個(gè)像素點(diǎn)中紅綠兩種熒光信號(hào)灰度值得到其在圖中的坐標(biāo)，展現(xiàn)分子共定位和相互作用程度。
3 Statistics里面即顯示共定位分析結(jié)果：Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等。既可以對(duì)整張圖進(jìn)行分析，也可以使用區(qū)域選擇工具圈出感興趣區(qū)域ROI進(jìn)行分析。
4 Parameters 為了得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，可以進(jìn)行相關(guān)的參數(shù)設(shè)置。
ThresholdCh 1& ThresholdCh 2：灰度值低于設(shè)定閾值的像素不納入共定位分析范圍
Background Ch 1 & Background Ch 2：灰度值低于設(shè)定閾值的像素作為背景不納入共定位分析范圍。
也可以使用區(qū)域選擇工具在散點(diǎn)圖中圈出共定位分析的灰度值范圍。
共定位結(jié)果的精準(zhǔn)度與圖像的分辨率密切相關(guān)。但由于衍射極限的存在，常規(guī)共聚焦光學(xué)分辨率只有200nm左右，如果是觀察大于200nm的結(jié)構(gòu)當(dāng)然輕松，也很容易就能準(zhǔn)確判斷其共定位程度，但細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞器、蛋白結(jié)構(gòu)等尺寸往往更小，我們?nèi)绻枨蟾珳?zhǔn)的結(jié)果就需要選擇與之匹配的超高分辨率成像技術(shù)：如達(dá)到120nm的高分辨率LIGHTNING技術(shù)，達(dá)到30~50nm的超高分辨率STED技術(shù)（圖2）等。隨著分辨率的提高我們可以看到的結(jié)構(gòu)越來(lái)越精細(xì)，得到的共定位結(jié)果當(dāng)然越來(lái)越準(zhǔn)確。所以在進(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)時(shí)我們可以盡量選擇更高分辨率的成像方式。
此外在樣品準(zhǔn)備和采圖時(shí)：
1) 串色會(huì)嚴(yán)重干擾到共定位結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)可盡量選擇串色較少的染料組合以避免串色帶來(lái)的干擾；如果選擇的染料串色，采圖時(shí)也可以優(yōu)化調(diào)節(jié)檢測(cè)范圍以排除串色干擾，當(dāng)然也可以使用序列掃描的方式。
2) 采圖時(shí)盡量選擇高數(shù)值孔徑的物鏡以獲取最優(yōu)分辨率，同時(shí)注意采樣頻率需要滿足Nyquist采樣定理（可通過(guò)Optimize xy-Format功能來(lái)調(diào)節(jié)format實(shí)現(xiàn)），從而得到與最優(yōu)分辨率匹配的pixel size，以避免采樣頻率不足導(dǎo)致的信息丟失，以及采樣頻率過(guò)高可能引起的光漂白。
3) 采圖時(shí)確保各熒光通道不過(guò)曝，盡量獲取信噪比好的圖像。優(yōu)異的原始數(shù)據(jù)是后期定量分析和去卷積處理的最佳保障。
4) 采圖后可進(jìn)行去卷積處理（如Huygens或者HyVolution中的deconvolution）以獲取信噪比、分辨率更好的數(shù)據(jù)，得到更準(zhǔn)確的共定位分析結(jié)果。
5) 共定位分析有多種分析算法，如Pearson's Correlation，Overlap Coefficient，Colocalization Rate等，每種算法都有各自的特點(diǎn)和最佳適用情況，所以我們需要根據(jù)具體情況來(lái)選擇，或者采用結(jié)合多種算法結(jié)果來(lái)分析【1】【2】【3】。
最后，祝大家可以輕松愉快地做好共定位分析實(shí)驗(yàn)啦。